腺病毒和慢病毒包装服务

来自 : 发布时间：2024-04-30

提供商：	生工生物工程
服务名称：	病毒包装

10-1 腺病毒包装服务         腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种非整合型双链DNA病毒。 由于其可以感染呼吸道和消化道，不仅可以静脉注射，还可以通过口服经肠道吸收或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收，使得它所介导的基因治疗易于推广应用，并且腺 病毒易于制备、纯化和浓缩、外源基因装载容量大，所以重组腺病毒已越来越广泛地被应用于基础研究和临床试验中，并成为世界上最常用的基因治疗载体之一。           生工所用的腺病毒包装系统是AdMax系统。辅助包装质粒pBHG lox ΔE1,3 Cre序列信息请从以下网址下载：http://www.microbix.com/Plasmid-Sequences/pBHGloxdeltaE13Cre.zip， 它的工作原理是将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染HEK293细胞，利用Cre/loxP（或FLP/frt）重组酶系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。      这个系统操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因的表达水平高。与目前使用最普及的AdEasy系统相比，有一定的优势：AdMax系统只需要 2~4周就能完成从质粒构建到重组出毒，成功率大于98%，因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性，并且 病毒的产率（yielding）明显提高。 包装过程  10-2 慢病毒包装服务       慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构和特性，是目前应用最广泛的另一种病毒表达系统。载体是以HIV-1（人类 免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性稳定表达的效果。重组慢病毒比逆转录病毒具有更高的滴 度，可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。                   生工慢病毒载体是以国际通用的第三代载体系统为基础，通过一定改建、构成四质粒体系。其中转移载体（transfer vector）包含转移目的基因的慢病毒骨架及其包装产生相应基因组RNA的所有顺式作用元件，可以单一或多重组合的稳定或条件诱导下表达转移基因或 shRNA；另外，通过三个辅助质粒提供病毒包装所需的反式作用因子，同时采用\"自我灭活”修饰，阻止子代病毒自我复制和转移，从而确保产生的慢病毒具备 良好的生物安全性。四质粒载体：  

 

LV1:pGLV-U6-EGFP	LV1:pGLV-U6-Puro
LV1:pGLV-U6-EGFP+Puro	LV1:pGLV-EF1a-EGFP

 10-2-1 主要特点          1. 删除了全部HIV-1编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1蛋白的表达；      2. 对5’和3’ LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR删除U3，使其不再具有启动/增强活性，成为自灭活（self- inactivating, SIN）载体；      3. 病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；      4. 与MuLV等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；      5. 慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有4千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件，而MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性；       6. 慢病毒的LTR的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也相对较低。 W11-2-2 包装过程 10-3 腺病毒载体系统和慢病毒载体系统比较

相关特性	腺病毒表达系统（Adenovirus）	慢病毒表达系统（Lentivirus）
病毒基因组	双链DNA病毒	RNA病毒
复制	自主复制	自主复制
是否整合	病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因	病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因
感染细胞类型	感染分裂和不分裂细胞	感染分裂和不分裂细胞，适合难转染的原代细胞（如神经细胞、淋巴细胞）及体内实验
表达丰度	高水平表达	中水平表达
表达时间	快（1~2 天）	慢（1~3天）
滴度	滴度高达1011 pfu/ml	滴度最高可达108 pfU/ml
克隆容量	可插入高达8 kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低	可插入不超过8 kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低
免疫原性	高免疫原性	低免疫原性

10-4 服务流程：

 

10-5服务价格与周期

服务内容	提供产品量	价格（元）	实验周期
载体构建	构建报告	询 价	2~4周
腺 病 毒	病毒包装	上清10 ml ≥1×108~9 PFU/ml	6,500	2~3周
ADGFP对照腺病毒	1~2 ×1011 PFU/ml	2,500	/
标签抗体WB检测	WB检测报告	2,000	1~2周
慢 病 毒	过表达慢病毒	1 ml ≥1×109 UT/ml	8,000	2~3周
对照慢病毒	1 ml ≥1×109 UT/ml	2,000	/
滴度检测报告单	2份	/	/
目的基因RT-PCR检测	检测报告单	2,000	1~2周
目的基因表达WB检测	检测报告单（客户提供一抗）	2,000	2~3周